IKUTAN LOMBA PBB DI SMP NEGERI 2 CIAMIS HADUH PANAS!

YAYA--NIEENOOT

I.              JUDUL

1.1. Kultur Bakteri dan Morfologi Koloni Bakteri

1.2. Pewarnaan Bakteri

1.3. Uji Kepekaan Bakteri terhadap Antibiotik

II.           TUJUAN

-       Membuat kultur bakteri

-       Mengamati morfologi koloni bakteri

-       Membedakan bakteri Gram positif dan Gram negative

-       Mengamati bentuk sel bakteri

-       Menguji kepekaan bakteri terhadap Antibiotik

III.        DASAR TEORI

2.1    Medium  Biakan 

Mikroorganisme dapat dibiakan dalam air yang sudah  ditambah dengan nutrien yang sesuai. Medium biakan adalah larutan encer  yang mengandung nutrien penting, yang menyediakan  kebutuhan bagi sel mikroba supaya dapat tumbuh dan menghasilkan banyak sel yang serupa. Di samping sumber energi berupa senyawa organik dan anorganik  atau cahaya,  medium biakan harus memiliki sumber  karbon, nitrogen dan nutrien penting lainnya. Medium biakan dapat disiapkan   dalam keadaan cair   maupun gel   (semi padat). Dari cair  dapat  diubah menjadi padat dengan penambahan agar. Medium biakan  yang mengandung agar dapat disimpan dalam bentuk   lempeng pada  cawan Petri  tertutup, dimana sel mikroba dapat tumbuh dan membentuk massa  yang terlihat  sebagai  koloni sel. Disamping itu medium biakan yang mengandung agar dapat pula disimpan dalam tabung reaksi dengan kemiringan tertentu, dimana sel mikroba dapat tumbuh dengan memberikan karakteristik pertumbuhan yang khas.

2.2    Konsep Biakan Murni 

Medium agar merupakan substrat yang baik untuk memisahkan campuran mikroba sehingga masing-masing jenis dapat terpisah. Teknik yang sering digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada medium agar diharapkan mikroba tersebut  dapat tumbuh agak berjauhan dari sesamanya, juga setiap selnya berhimpun membentuk koloni. Koloni merupakan sekelompok masa sel yang dapat dilihat dengan mata langsung. (gambar 2.1).   Semua sel dalam koloni itu sama; dianggap semua sel itu merupakan keturunan (progeny) satu mikroorganisme dan karena itu mewakili sebagai biakan murni. 

Gambar 2.1 Koloni bakteri pada suatu medium lempeng agar 

2.3    Bulyon Agar (Lempeng Agar)

Susunannya sama dengan pembenihan bulyon (cair) hanya ditambah dengan 2 % agar-agar. Pembenihan ini ketika masih panas (masih cair) dituangkan ke dalam tabung reaksi atau cawan petri/petri dish. Bila sudah dingin, akan menjadi padat. Koloni dari setiap jenis bakteri selalu mempunyai bentuk yang tetap, sehingga dengan melihat bentuk koloninya saja, sudah dapat di duga jenis bakteri yang sedang diselidikinya. Misalnya:

·      koloni Vibrio cholera, bening seperti tetes air embun.

·      koloni Staphylococcus dan Streptococcus pyogenes keruh seperti nanah, di mana koloni Staphylococcus besar-besar sedangkan koloni Streptococcus kecil-kecil.

·      koloni Vibrio cholera, baik pinggir maupun permukaannya licin disebut smooth colony (koloni S) sedangkan koloni Corynebacterium diptheriae tidak rata (bergerigi) dan disebut rough colony (koloni R)

2.4    Teknik Menanam Dalam Pembenihan Agar Lempeng

A.  Oese yang sudah mengandung biakan diletakkan di atas permukaan agar dan segera ditarik ke atas sambil membuat garis-garis berupa zig-zag.

B.  Sama seperti yang A di buat garis-garis yang zigzag namun agar lempeng tersebut dibagi menjadi empat bagian terlebih dahulu.

C.  Tutup lempeng dibuka dan tetap dipegang dengan tangan kiri, kemudian oese yang mengandung biakan (bahan pemeriksaan) dioleskan pada permukaan agar dengan membuat garis-garis sebanyak mungkin tetapi masing-masing terpisah.

D.  Pada cara ini bagian pinggir lempeng seolah-olah dipakai untuk menipiskan bahhan pemeriksaan sedang pada bagian tengah diharapkan tumbuh koloni-koloni yang terpisah satu sama lain sehingga koloni-koloni tersebut dapat diasingkan untuk jadi biakan murni.

 

2.5    Alat Dan Bahan-Bahan Laboratorium

Alat-alat dan bahan-bahan  yang biasa dipakai dalam laboratorium mikrobiologi yaitu:

A.       Alat-Alat Dapur

Autoklaf, sterilisator kering, lemari pengeram, lemari pendingin, lemari pengering, dll.

B.       Alat Laboratorium Dan Pembenihan

-  Tabung ( tabung reaksi, tabung presipitasi, tabung WR, tabung Widal, tabung kentang, tabung Durham, dll).

-  Alat inokulasi (tugal bermata, jarum dan tugal jamur).

-  Sudip (soatel) Drigalski, sudip lidah.

-  Pipet (Pasteur, Kahn, balon, berukuran).

-  Lempeng petri (nbermacam-macam ukuran, Fortner).

-  Kaca alas (biasa, cekung), kaca tutup.

-  Sungkup (eksikator, Klein, anaerob).

-  Saringan bakteri (Seitz, Chamberland, Pukal).

-  pH meter.

-  Nefelometer.

-  Pinset (sediaan, anatomi, chirurgi).

-  Penghitung koloni, bilik hitung.

-  Semprit (biasa, Mantoux).

-  Perbenihan cair: air pepton, kaldu (bulyon),deret gula-gula, dll.

-  Perbenihan padat: agar miring, agar lempeng, agar tegak, Loeffler, TSIA, Lowenstein.

-  Perbenihan ½ padat (semi-solid agar).

2.6    Morfologi Koloni

Populasi bakteri tumbuh sangat cepat ketika mereka disertakan dengan gizi dan kondisi lingkungan yang memungkinkan mereka untuk berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis bakteri kadang-kadang akan menghasilkan koloni yang khas dalam penampilan. Beberapa koloni mungkin akan berwarna, ada yang berbentuk lingkaran, sementara yang lain tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk, ukuran, warna, dll) yang diistilahkan sebagai "koloni morfologi". Morfologi koloni adalah cara para ilmuwan dapat mengidentifikasi bakteri.

Umumnya pada semua perbenihan padat baik yang berbentuk lempeng atau miring bakteri akan tumbuh dan membentuk koloni yang sifat-sifatnya sangat berlainan dank has untuk tiap jenis bakteri. Dengan begitu apabila kita mengetahui cirri-ciri koloni suatu kuman maka pengetahuan tersebut sangat membantu kita dalam usaha memisahkan atau mengisolasinya.

Sifat (ciri-ciri)) koloni bakteri meliputi:

Bentuk        : datar, konveks, kubah (capitate), berlekuk tengah (umbilicate), datar meninggi (raised), muncung (pulvinate), bentuk gong (umbonate).

Ukuran        : diameter rata-rat dalam millimeter.

Rupa           : seperti titik (punctiform), bulat, berfilamen, rhizoid, tak teratur (irregular).

Permukaan : licin (smooth), kasar (rough), berjari (radiate), berlingkaran konsentris.

Pinggir        : rata, berombak, berfilamen, keriting, (curled), pecah-pecah (erose).

Daya tembus cahaya : opaque, semitransparent, transparent.

Warna         : kuning, merah, hijau, berfluoresensi, dll.

Kepadatan : berlendir, likat, seperti mentega, rapuh.

 

2.7    Pewarnaan Bakteri

Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Itu berarti bahwa jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya, bakteri ini akan sangat sulit untuk dilihat dengan teliti di bawah mikroskop. Oleh karena itu, agar dapat dilihat dengan jelas maka bakteri tersebut haruslah diwarnai/dilakukan pengecatan terlebih dahulu.

Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya mikrobiologi di pertengahan abad ke- 19 oleh Loius  Pasteur dan Robert Koch. Pewarnaan bakteri dapat dilakukan dengan satu macam zat warna ataupun lebih. Pewarnaan bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna disebut pewarnaan sederhana. Pewarnaan dengan menggunakan lebih dari satu macam zar warna diberi nama sesuai dengan nama penemunya. Pada umumnya, ada dua macam zat warna (bahan cat) yang sering dipakai, yaitu sebagai berikut:

·       Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk garam natrium

·       Zat warna yang bersifat alkalis, dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk klorida.

Pada pewarnaan sederhana yang sering dipakai adalah methylen blue. Hasil pewarnaannya akan lebih baik bila diberi sedikit KOH  (Kalium Hidroksida). Larutan ini disebut Loffer methylen blue.

Cara-Cara Pewarnaan

a.    Pewarnaan Sederhana

Tujuan pengecatan ini ialah untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan cat hanya terdiri dari satu bahan cat yang dilarutkan dalam suatu bahan pelarut. Bahan-bahan yang banyak dipakai untuk keperluan ini adalah karbol fuksin, kristal violet, dan methylen blue.

b.   Pewarnaan Diferensial

Untuk pewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan cat. Dengan cara ini bahan-bahan cat yang dipakai adakalanya terpisah, atau adakalanya dicampur dan digunakan dalam satu larutan. Dua macam pewarnaan/pengecatan yang terpenting dari golongan ini ialah pengecatan Gram dan pengecatan tahan asam seperti pengecatan Ziehl-Naelsen.

Sediaan oles (preparat) untuk proses pengecatan dibuat sebagai berikut:

A.  Ambil satu gelas objek yang bersih dan bebas lemak, tandai berupa bulatan. Letakkan satu oese suspense biakan diatas gelas tersebut.

B.  Suspense dioleskan seluas garis tanda berupa bulatan.

C.  Sediaan dikeringkan (diuapkan) di udara atau dihangatkan jauh di atas api.

D.  Lakukan fiksasi diatas api kecil tiga kali berturut-turut masing-masing selama satu detik, dengan cara dilewatkan diatas api.

E.   Dinginkan sebentar di udara, untuk kemudian dilakukan pewarnaan.

Yang dimaksud dengan fiksasi ialah melekatkan bakteri pada kaca objek, mematikan bakteri dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi ini harus dilakukan setelah preparat kering.

1)   Pewarnaan Gram (Christian Gram)

Pewarnaan ini pertama kali dikemukakan oleh Christian gram (1884). Dengan pengecatan ini film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentin violet (karbol kristal violet, karbol metilviolet) dan didiamakan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai, semua bakteri akan berwarna ungu. Untuk lebih jelasnya berikut adalah tahap-tahap pewarnaan:

A.  Pada sediaan oles yang sudah disiapkan, tuangkan satu atu dua tetes zat warna karbol-gentian ungu, biarkan satu menit.

B.  Zat warna dibuang dan segera diberi larutan lugol (tanpa dicuci terlebih dahulu), biarkan satu menit.

C.  Lugol dibuang dan sediaan cuci dengan alcohol 96% sampai tak ada lagi zat warna yang terlarut, dengan cara dicelupkan.

D.  Cuci dengan air sampai bersih.

E.   Tuangi larutan air fukhsin/safranin dan biarkan satu menit.

F.   Cuci lagi dengan air sampai bersih.

G. 

Keringkan dengan kertas saring, lalu amati dibawah mikroskop.

Hasil pewarnaan:

-       Bakteri gram positif berwarna ungu

-       Bakteri gram negative berwarna merah

Dengan pewarnaan Gram, ada beberapa bakteri yang dapat menahan zat warna ungu (karbol kristal violet, karbol metilviolet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol dan aseton. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Positif. Sebaliknya, bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alkhol dan seton akan kembali menjadi tidak berwarna dan  bila diberikan pengecetan dengan zat  warna kontras akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Negatif.

2)   Pewarnaan Ziehl Neelsen

Pewarnaan ini juga disebut dengan pengecetan tahan asam. Disebut deikian karena pada beberapa jenis bakteri sukar dilakukan pengecetan. tetapi sekali dapat tercat tidak mudah untuk dilunturkan meskipun dengan menggunakan zatpeluntur (decolorizing agent) asam (atau sam-alkohol). Yang termasuk bakteri yang sukar dicat adalah dari genus Mycrobacterium (Mycrobacterium tuberculosis. Mycobacterium leprae, Mycobacterium smegmatis). Bakteri tahan asam sangat banyak mengandung lipida, asam lemak, dan kandungan inilah yang mencerminkan sifat tahan asam pada golongan bakteri tersebut antara lain asam mikolat. Cara pengecetannya ialah:

1.    Film bakteri pada kaca objek yang telah difiksasi, disiram dengan karbolfuksin, kemudian dipanaskan sampai keluar uap (tidak sampai mendidih). Pemanasan diulang beberapa kali agar bahan cat tetap hangat kemudian didiamkan selama lima menit.

2.    Dekolorisasi dilakukan dengan asam-alkohol dalam waktu yang singkat, kemudian cepat dicuci dengan air.

3.    Pengecetan dengan cat kontras dilakukan dengan metil biru dalam larutan KOH 1/10000

4.    Setelah dicuci kembali dengan air preparat dikeringkan di udara.

Dengan pewarnaan ini, bakteri dibagi dalam 2 golongan, yaitu:

1.    Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl neelsen disebut bakteri tahan asam 9acid fast)

2.    Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non-acid fast)

3)   Pewarnaan Neisser dan Albert

Di antara bakteri bentuk batang Gram positif, ada yang di dalam selnya ditemukan granula polifosfat yang disebut juga granula metakromatik atau volutin bodies. granula ini bersifat kromofil dan metakromatik yang berarti mempunyai aktivitas kuat terhadapa zat-zat warna, dan seringkali tampak lain dari zat warna yang diberikan. Berikut adalah langkah-langkah pengecetannya:

1.    Sebagai bahan cat disediakan tiga macam larutan, yaitu:

·        Neisser A isinya methylen blue

·        Neisser B isinya gentian violet

·        Neisser C isinya chrysoidin (berwarna kuning)

2.    Untuk pengecetan pertama digunakan larutan A dan B yang dicampur sesaat sebelum pengecatan dalam perbandingan dua bagian larutan A dengan satu bagian larutan B. Lama pengecatan adalah setengah menit

3.    Setelah campuran tersebut dibunag preparat dibilas dengan larutan dan larutan ini didiamkan di atas film preparat selama ½ - 1 menit, kemudian dikeringkan dengan kertas saring.

Selain itu, untuk menonjolkan granula metakromatik ini dapat pula dilakukan pengecetan Albert, yaitu:

1.    Preparat dicat dengan larutan cat menurut Albert selama 3-5 menit

2.    Setelah dicuci dengan air, preparat disiram dengan larutan iodium (menurut Gram) dan ditunggu satu menit. kemudian dicuci kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring.

Hasil Pengecetan:

1.    Pada pengecetan Neisser: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma berwarna kuning (krisoidin) atau tengguli/kecoklat-coklatan (Bismarck brown)

2.    Pada pengecetan Albert: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma hijau

***Semua bakteri Gram negatif tidak tahan asam, sedangkan bakteri Gram positif ada yang tahan asam dan ada yang tidak tahan asam***

2.8    Uji Kepekaan terhadap Antibiotik

Bahan kimia, berbagai jenis bahan kimia dapat menghambat pertumbuhan kuman, misalnya kadar gula yang tinggi, zat warna, desinfektan, antibiotika. Bahan kimia ini dapat menghambat pertumbuhan kuman, disebut efek bakteriostatik, atau dapat membunuh kuman, disebut efek bakterisid. Disinfektan adalah bahan kimia yang digunakan untuk sanitasi, disinfeksi, antisepsis, dan membunuh kuman.

Antibiotika sering digunakan untuk mengobati berbagai penyakit infeksi bakterial. Antibiotika dapat bersifat bakteriostatik dan juga bakterisid. Dalam melakukan terapi dengan menggunakan antibiotika guna penanggulangan penyakit infeksi bakterial, kadang diperlukan pemeriksaan kepekaan (tes sensitivitas) kuman terhadap antibiotik yang tersedia, karena pada masa kini telah banyak ditemukan kuman yang resisten terhadap antibiotika. 

Pemeriksaan kepekaan kuman terhadap antibiotika dilakukan dengan :

1.         Cara Cakram (Disc Method), menggunakan cakram kertas saring yang mengandung antibiotika/bahan kimia lain dengan kadar tertentu yang diletakkan di atas lempeng agar yang ditanami kuman yang akan diperiksa, kemudian di inkubasi. Apabila tampak adanya zona hambatan pertumbuhan kuman disekeliling cakram antibiotika, maka kuman yang diperiksa sensitif terhadap antibiotika tersebut, Cara ini disebut juga cara difusi agar, yang lazim dilakukan adalah cara Kirby-Bauer.

Uji Kepekaan terhadap Antibiotik (Metode Kirby-Baueur)

Tujuannya untuk mengetahui apakah suatu jenis bakteri resisten, intermedit atau sensitive terhadap antibiotic tertentu.

Alat dan bahan :

-          Cawan petri -          Tugal/jarum inokulasi -          Lidi kapas steril -          Standar Mc-Farland 0,5 -          Inkubator

-          Bakteri uji -          Cakram antibiotic -          NaCl fisiologis -          Muller Hinton Agar

Cara kerja :

·      Membuat inokulum bakteri, dengan cara mengambil 3-5 koloni bakteri yang akan diuji dari cawan petri, dengan menggunakan tugal.

·      Koloni yang diambil tadi dimasukkan pada sebuah tabung reaksi yang berisi NaCl fisiologis steril, sehingga terbentuk suspense bakteri yang akan diuji.

·      Suspense tersebut, lalu dibandingkan dengan standar Mc-Farland 0,5, kalu terlalu keruh ditambah NaCl fisiologis steril, kalu terlalu encer di tambah koloni bakteri sampai dicapai kekeruhan yang sama dengan standar Mc-Farland 0,5.

·      Suspense bakteri tersebut diambil dengan menggunakan lidi kapas steril. Supaya tidak terlalu banyak suspense yang terambil, setelah dicelupkan lidi kapas tersebut ditekan-tekan pada dinding tabung reaksi, di atas permukaan suspense bakteri.

·      Lidi kapas tersebut, lalu diapuskan pada semua permukaan media. Inokulum dibiarkan mongering selama 3-5 menit pada temperature kamar dengan tertutup.

·      Cakram antibiotic diletakkan pada inokulum di atas permukaan Mueller Hinton agar dengan menggunakan pinset steril.

·      Diinkubasikan dalam incubator pada suhu 37⁰ C selama 24-48 jam.

·      Mengukur zona hambat yang terbentuk dengan menggunakan kalifer.

·      Menentukan apakah bakteri tersebut resisten, intermedit, atau sensitive terhadap antibiotic tertentu, dengan cara membandingkan zona hambat hasil pengukuran dengan tabel yang tersedia.

No	Antibiotik	Diameter Zona Hambat
		R	I	S
1	Metisilin (MET)	≤ 9	10-13	≥ 14
2	Azitromycin (AZM)	≤ 13	14-17	≥ 18
3	Eritromycin (E)	≤ 13	14-22	≥ 23
4	Ciprofloxacin (CIP)	≤ 15	16-20	≥ 21

2.         Cara Tabung (Tube Dilution Method), membuat penipisan antibiotika pada sederetan tabung reaksi yang berisi perbenihan cair. Ke dalam tabung-tabung tersebut dimasukkan kuman yang akan diperiksa dengan jumlah tertentu dan kemudian dieram. Dengan cara ini akan diketahui konsentrasi terendah antibiotika yang menghambat pertumbuhan kuman yang disebut Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) atau Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

IV.        HASIL PENGAMATAN

4.1    Percobaan ke I

a.    Kultur Bakteri

 

b.   Morfologi Koloni Bakteri

Terdapat dua koloni bakteri yang berasal dari tenggorokan praktikan yaitu Streptococcus pneumonia yang mempunyai ukuran koloni yang lebih kecil 0,2-0,3 mm dan Staphylococcus aureus yang memiliki ukuran lebih besar dengan ciri-ciri sebagai berikut:

Ciri-ciri	Staphylococcus aureus
Bentuk Ukuran Rupa Permukaan Pinggir Daya tembus cahaya Warna kepadatan	Konveks 4-5 mm Tidak teratur (ireregular) Berjari (radiate) Pecah-pecah (erose) Semitransparan Kuning

4.2    Percobaan ke II

Pewarnaan Gram

Setelah diberikan pewarnaan maka hasil yang di peroleh pada sediaan oles tersebut berwarna ungu sehingga bakteri tersebut merupakan bakteri gram positif. Dan bentuk sel bakterinya coccus berantai (streptococcus)

 

4.3    Percobaan ke III

Tabel Hasil Pengamatan Uji Kepekaan Bakteri Terhadap Antibiotik Kelompok 1

No	Antibiotik	Panjang zona hambat (mm)	Diameter zona hambat
1	Meticilin (met)	7 mm	Resisten (R)
2	Azitromycin (Azm)	13 mm	Resisten (R)
3	Eritromycin (E)	32 mm	Sensitif (S)
4	Ciprofloxacin (CIP)	23 mm	Sensitif (S)

Tabel Uji Kepekaan Bakteri Terhadap Antibiotik

No	Antibiotik	Diameter Zona Hambat (mm)
		I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII
1	MET	7 (R)	6 (R)	6 (R)	6 (R)	6 (R)	6 (R)	6 (R)	6 (R)
2	AZM	13 (R)	26 (S)	24 (S)	23 (S)	26,3 (S)	20 (S)	22 (S)	23 (S)
3	E	32 (S)	30 (S)	27 (S)	28 (S)	26,4 (S)	28 (S)	29 (S)	25 (S)
4	CIP	23 (S)	27 (S)	26 (S)	22 (S)	12 (R)	23 (S)	27 (S)	26 (S)

Keterangan:

MET           : Metisilin

AZM           : Azitromycin

E                 : Eritromycin

CIP             : Ciprofloxacin

V.           PEMBAHASAN

5.1    Percobaan ke I

a.    Kultur bakteri

Berdasarkan hasil kultur bakteri didapatkan dua koloni bakteri, yang satu berukuran besar yaitu Staphylococcus aureus dan yang lainnya berukuran lebih kecil (seperti titik) yaitu Streptococcus pneumonia. Hal ini berarti terdapat dua spesies bakteri yang berbeda. Kedua bakteri tersebut yaitu Staphylococcus aureus dan Streptococcus pneumonia.

b.    Morfologi Koloni Bakteri

Pada praktikum ini dilakukan pengamatan koloni bakteri yang terbentuk dari pengkulturan bakteri yang berasal dari tenggorokan manusia. Berdasarkan hasil penelitian kelompok kami, didapat koloni bakteri Staphylococcus aureus yang memiliki ciri-ciri koloni berbentuk konveks,ukuran 4-5 mm, rupa tidak teratur (irregular), permukaan berjari (radiate), pinggirnya pecah-pecah (erose), daya tembus cahaya semitransparan dan warna kepadatannya kuning.

5.2  Percobaan ke II

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram merupakan suatu metode atau teknik pewarnaan diferensial yang penting untuk membedakan atau mencirikan bakteri. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi diberi larutan tertentu yaitu ungu kristal, iodium, alkohol dan safranin. Bakteri yang sudah diberi warna dengan menggunakan metode pewarnaan inidapat dibedakan menjadi  dua kelompok yaitu gram positif dan gram negatif.

Berdasarkan praktikum yang telah kami lakukan diketahui bahwa baik koloni satu maupun koloni dua yang diambil dari hasil biakan pada media lempeng merupakan gram positif. Ini di dasarkan pada hasil akhir pewarnaan yang menghasilkan warna ungu. Hal ini di dasarkan pada kemampuan bakteri untuk mempertahankan warna ungu dan kristal violet selama pelunturan warna (decolorization) oleh alcohol. Bakteri gram negatif di dekolorisasi oleh alcohol dan melepaskan warna Kristal violet. Bakteri positif tidak dapat di dekolorisasi oleh alcohol dan tetap berwarna ungu. Setelah proses dekolorisasi, zat warna merah counterstain, safranin digunakan untuk menghasilkan warna merah muda pada organism gram negative yang sudah di dekolorisasi. Pada waktu zat pemantek (mordant) iodium diberikan selama satu menit, warna bakteri tetap sama yaitu ungu. Fungsi dari zat pemantek disini adalah bereaksi dengan Kristal violet untuk membentuk senyawa yang relative tidak larut pada bakteri gram positif. pada waktu zat peluntur warna (decolorizing agent), etanol (acetone-alcohol) 95% diberikan pada preparat selama 10-20 menit, bakteri gram negative menjadi luntur tidak berwarna sedangkan yang gram positif tetap berwarna ungu. Pada tahap akhir, zat warna counterstain, safranin membuat bakteri gram negative berwarna merah muda, dan warna ungu dari bekteri gram positif tidak terpengaruh. Dari semua teknik pewarnaan untuk mengidentifikasi bakteri, pewarnaan gram merupakan cara yang paling berguna.

Pada pewarnaan gram ini, bakteri terbagi dalam dua kelompok, hal ini diduga karena bakteri gram negative mempunyai kandungan lipid (magnesium ribonukleat, asam lemak tak jenuh) yang tinggi dalam dinding selnya, perendaman/pencucian dengan alcohol akan melarutkan lemak dan Kristal violet dari dinding sel. Sedangkan bakteri gram positif mempunyai lipid yang lebih sedikit, sehingga zat warna tidak larut. Teori lain menyatakan bahwa dinding bakteri gram positif mengandung lebih banyak peptidoglikan (30 lapis) yang memerangkap ikatan Kristal ungu-yodium dalam berbagai ikatan silang membentuk molekul yang besar, sehingga tidak dapat lepas keluar pada saat diberi alcohol. Selain itu dikatakan pula bahwa pada dinding sel bakteri gram positif terjadi denaturasi protein karena pencucian dengan alcohol sehingga menjadi keras dan beku. Pori-pori mengecil dan kompleks Kristal ungu-yodium dipertahankan sehingga bakteri tetap berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram negative mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis (1-2 lapisan) dan susunan dinding sel tidak kompak, permeabilitas selnya lebih besar, sehingga memungkinkan terlepasnya kompleks Kristal ungu-yodium. Perbedaan lain dari kedua kelompok gram tersebut adalah kepekaannya terhadap berbagai macam antibiotika, nutrisinya, produksi toksin dll.

5.3  Percobaan ke III

Berdasarkan hasil praktikum dari uji kepekaan terhadap antibiotik, didapat hasil yang resisten dan sensitive. Bakteri yang menggunakan antibiotic metisin memiliki zona hambat berdiameter 7 mm dan bersifat resisten, pada Azitromycin memiliki diameter zona hambat 13 mm dan bersifat resisten, pada antibiotic Eritromycin memiliki diameter zona hambat 32 mm dan bersifat sensitive, pada Ciprofloxacin memiliki diameter zona hambat 23 mm dan bersifat sensitive. Penentuan ukuran zona hambat diatas diukur dengan menggunakan jangka sorong dan didapat hasil seperti diatas.

         Zona hambat pada bakteri terdiri dari 3 kategori yaitu resisten, intermediet, dan sensitive yang ditandai dengan adanya bagian yang berwarna bening pada media bakteri. Bagian bening ini merupakan bagian yang tidak ditumbuhi bakteri, karena terjadi proses difusi dari cakram ke lingkungan sekitarnya.

VI.        JAWABAN PERTANYAAN

Percobaan I

1.    Apa fungsi agar-agar pada media tumbuh bakteri?

2.    Apakah agar-agar tersebut di metabolisme oleh bakteri?

Jawaban

1.    Fungsi agar-agar adalah sebagai pemadat dan tidak menyediakan zat-zat gizi untuk bakteri, selain sebagai pemadat agar juga digunakan untuk tempat menyimpan nutrisi-nutrisi yang nantinya akan digunakan oleh bakteri.

2.    Agar-agar tidak dimetabolisme oleh bakteri, karena agar hanya sebagai pemadat saja dan tidak menyediakan nutrisi apapun. Yang dimetabolisme oleh bakteri adalah unsur-unsur seperti unsur makro (C,H,O,N,dan P) dan mikro (Fe dan Mg).

Percobaan II

1.    Jelaskan fungsi alkohol pada pewarnaan?

2.    Jelaskan faktor-faktor yang menyebabkan perbedaan reaksi terhadap zat warna pada bakteri yang saudara uji!

Jawaban

1.    Fungsi alkohol adalah untuk melunturkan atau mencuci zat warna utama (decolorization)

2.    Perbedaan reaksi terhadap zat warna pada bakteri disebabkan karena adanya reaksi bakteri terhadap pewarnaan tersebut. Ini didasarkan pada kemampuan bakteri untuk mempertahankan warna ungu dan kristal violet selama proses decolorization oleh alkohol. Pada bakteri gram negatif didekolorasi oleh alkohol sehingga melepaskan warna kristal violet. Setelah proses dekolorisasi safranin digunakan untuk menghasilkan warna merah muda dan diberikan zat pemantek yang akan bereaksi dengan kristal violet untuk membentuk senyawa yang relatif tidak larut pada bakteri Gram positif.  Sedangkan bakteri gram positif tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol dan tetap berwarna ungu. Selain itu, faktor lain yang menyebabkan terjadinya perbedaan reaksi adalah kandungan lemak yang terkandung. Bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tinggi dalam dinding selnya, pencucian dengan alkohol akan melarutkan lemak dan kristal violet dari dinding sel. Sedangkan bakteri gram positif mempunyai lipid yang lebih sedikit, sehingga zat warna tidak larut.

Percobaan III

1.     Apa materi genetik diluar kromosom yang dapat bereplikasi secara autonom yang membawa sifat-sifat khusus bakteri?

2.    Apa perbedaan sifat antara plasmid dan transposon?

3.    Apa makna yang bisa saudara simpulkan mengenai terbentuknya zona hambat (daerah bening di sekitar cakram antibiotik)?

Jawaban

1.    Materi genetik diluar kromosom yang dapat bereplikasi secara autonom yang membawa sifat khusus bakteri adalah transposon dan plasmid.

2.    Plasmid merupakan elemen genetik yang bereplikasi secara bebas dari kromosom hospes.

Transposon merupakan sepotong DNA yang dapat berpindah dari satu lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel. Transposon tidak pernah hadir sendirian, pergerakan transposon (transposisi) muncul sebagai satu tipe rekombinasi antara transposon itu (tempat target) dan tempat DNA lainnya yang mengalami kontak dengan transposon. Di dalam suatu sel bakteri, transposon bisa berpindah-pindah selama berada di dalam kromosom itu, dari plasmid ke kromosom (atau sebaliknya), atau dari satu plasmid ke plasmid lainnya.

3.    Terbentuknya zona hambat disebabkan karena adanya proses difusi dari cakram ke lingkungan sekitarnya. Maknanya jika kita terinfeksi dengan bakteri Staphylococcus aurens maka yang dapat menghambatnya antibiotik yang bersifat sensitif  seperti Erytromycin dan Ciprofloxacin.

VII.     KESIMPULAN

7.1.  Percobaan 1

Berdasarkan pembahasan diatas hasil kultur bakteri didapatkan dua koloni bakteri, yang satu berukuran besar yaitu Staphylococcus aureus dan yang lainnya berukuran lebih kecil (seperti titik) yaitu Streptococcus pneumonia dengan cirri morfologi yang berbeda-beda.

7.2.  Percobaan 2

Berdasarkan pembahasan diatas, bakteri yang kami kultur merupakan bakteri gram positif  yang berwarna ungu dan berbentuk coccus berantai.

7.3.  Percobaan 3

Berdasarkan pembahasan diatas, pada bakteri yang menggunakan antibiotic metisin memiliki zona hambat berdiameter 7 mm dan bersifat resisten, pada Azitromycin memiliki diameter zona hambat 13 mm dan bersifat resisten, pada antibiotic Eritromycin memiliki diameter zona hambat 32 mm dan bersifat sensitive, pada Ciprofloxacin memiliki diameter zona hambat 23 mm dan bersifat sensitive.

VIII.  DAFTAR PUSTAKA

Anonymous. (2011). Medium Pembiakan Bakteri. [Online]. Tersedia: http://biologid.blogspot.com/2011/10/medium-pembiakan-bakteri.html [5 Februari 2012]

Dwidjoseputro, D. (1994). Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Hadiotetomo, R.S. (1993). Mikrobiologi dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia

Krisno, A. (2011). TEKNOLOGI PEMBIAKAN DAN PERTUMBUHAN MIKROORGANISME. [Online]. Tersedia: http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/14/teknologi-pembiakan-dan-pertumbuhan-mikroorganisme/ [5 Februari 2012]

Pradhika, E. Indra. (2008). KUNCI AWAL IDENTIFIKASI BAKTERI (morfologi koloni, morfologi sel dan pewarnaan gram). [online]. Tersedia:  http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html [5 Februari 2012]

Rizqi. (2008). Mikroum…Pewarnaan Gram. [online]. Tersedia: http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/ [5 Februari 2012]

Sarinah. (2011). UJI KEPEKAAN MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIKA. [online].  Tersedia: http://rynapunya.blogspot.com/2011/06/uji-kepekaan-mikroba-terhadap.html [5 Februari 2012]